Investigación Verano '16

Introducción:

          La neumonía es una infección en el pulmón la cual puede ser causada por varios factores como lo son: bacteria, virus u hongo. Esto causa una inflamación del tejido pulmonar la cual impide que el paciente respire como una persona saludable (10). Los síntomas característicos de la neumonía son: tos, disnea (dificultad respiratoria), expectoración (expulsión de flema y otras secreciones por la boca), hemoptisis (expulsión de sangre por la boca al toser), fiebre, hiporexia (pérdida parcial del apetito), entre otros (7).

          El factor biológico que causa la infección respiratoria, la edad del paciente, y su condición de salud son los determinantes de la fisiopatología del paciente. Utilizando pruebas microbiológicas estándar solo se puede identificar el agente biológico responsable de la neumonía en el 30-50% de los casos (4). Esto muestra la falta de métodos eficaces para el diagnóstico.

         La neumonía se puede clasificar bajo dos áreas: neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y neumonía hospitalaria la cual es adquirida en un centro sanitario. Las neumonías más comunes son esas causadas por bacterias y virus. Por ejemplo, la bacteria más común que le causa neumonía a personas sanas es conocida como Streptococcus pneumoniae. Aunque esta bacteria reside de forma asintomática en la nasofaringe de pacientes saludables, en pacientes inmunocomprometidos, tales como adultos mayores, niños, entre otros, la misma puede convertirse patogénica e invadir otros tejidos y causar infección. Se debe recalcar que hay una gran diferencia entre lo que es infección y colonización. Mientras que infección es la multiplicación de agentes biológicos en el exterior o interior del huésped creando una reacción inmunológica, la colonización es la multiplicación en las mucosas o piel del huésped por el agente biológico sin crear una respuesta inmunológica. Al igual que la neumonía bacterial, la neumonía viral es más probable que se observe en niños pequeños, adultos mayores, personas con VIH y/o problemas pulmonares, y en personas que está en inmunosupresores debido a  un trasplante de órgano. Esto se debe a que estas personas no tienen el sistema inmunológico funcionando a su óptimo. 

          En un estudio reciente encontraron que la etiología más frecuente en aquellos pacientes con NAC que necesitan hospitalización en los Estados Unidos fue la viral en un 27% comparado con un 14% de causa bacteriana. Se encontró que el rinovirus (RV) era el microorganismo más frecuentemente detectado (en 9% de los pacientes) (4). Existen tres tipos de rinovirus: A, B y C. Entre estos tres tipos se detectan más de 160 genotipos distintos. El rinovirus es considerado el agente infeccioso humano más común en todo el mundo (5). Aunque están comúnmente relacionados con la infección del tracto respiratorio superior (ITRS), también juegan un papel importante en el desarrollo de infecciones del tracto respiratorio inferior (ITRI) como lo es la neumonía (9). Es importante estudiar cada genotipo de cada tipo por separado ya que cada uno puede influir el desarrollo de la infección de manera distinta.

En este proyecto, CRIPS- Neumonía por Virus Respiratorios en pacientes graves, los datos que se obtuvieron fueron de pacientes quienes adquirieron la neumonía en la comunidad (NAC). Éste se trata de un estudio prospectivo de casos y controles diseñados durante 30 meses para determinar la infección por rinovirus en pacientes ingresados en el Hospital Universitario de Vall d’Hebron con NAC.

Objetivos:

Objetivo Principal:

     Identificar la prevalencia e impacto clínico de la detección de las distintas especies y genotipos de virus respiratorios en muestras nasofaríngeas y de la vía respiratoria inferior en pacientes con diagnóstico de NAC ingresados en el hospital Vall d’Hebron.

Objetivos secundarios:

• • • • Evaluar la presencia, impacto clínico y evolución de la detección de RV y/o de las infecciones respiratorias mixtas por S. Penumoniae- rinovirus en pacientes adultos con NAC grave que necesitan ingreso en Unidades de Cuidado Intensivo.
      • Determinar si la carga viral de Rinovirus en muestras respiratorias (tanto del TRS como TRI) permite la clasificación de las infecciones del tracto respiratorio inferior según gravedad o colonización sin infección.
      • Detectar si alguna especie de rinovirus está asociada con la enfermedad clínica más grave en pacientes adultos con NAC.
      • Evaluar el uso de las técnicas microbiológicas para la detección de especies de RV como estudio de rutina en el ámbito hospitalario.
      • Determinar qué especies de RV predominan en las distintas estaciones del año en Barcelona.

Hipótesis:

• 
  
  • Las distintas especies de rinovirus (RV-A, RV-B y RV-C) estarían relacionadas con distintas presentaciones clínicas, RV-A se asociaría a una presentación más grave de NAC y RV-B estaría relacionada con el desarrollo de bronquitis.
  • Los casos de infección mixta por rinovirus + S. Pneumoniae están relacionados con una peor evolución de la NAC.

Justificación:

La neumonía es la sexta causa de mortalidad en los países desarrollados en el mundo (2). Como ejemplo del nivel de gravedad de la misma, se pueden observar de 7 a 15 casos por cada 1,000 personas cada año (2). Con relación a esto, es una de las principales causas de hospitalización y mortalidad en adultos en el mundo, lo cual conlleva a un alto uso de recursos sanitarios junto a una gran carga económica (8). Dado a esto es importante investigar dicha área. Al pasar los años se había creído que las bacterias tenían el mayor rol en la causa de la neumonía, pero con el aumento en técnicas modernas, se ha podido identificar que los virus pueden tener un rol aún más importante en la causa de la NAC. El papel del virus en la neumonía se puede confirmar con la pandemia de gripe en el año 2009 causado por el virus de la influenza A (8). El siguiente proyecto: CRIPS- Neumonía por Virus Respiratorios en pacientes graves, pretende ampliar el conocimiento de la neumonía causada por un agente viral para poder mejorar el modo diagnóstico y de tratamiento de los pacientes que sufren de la neumonía viral al igual que para indagar en la causa de las neumonías virales en pacientes graves.

Población a estudio:

Grupo A: pacientes menores de un año

Grupo B: pacientes entre 1 y 4 años

Grupo C: pacientes entre 5 y 17 años

Grupo D: pacientes entre 18 y 64 años

Grupo E: pacientes mayores de 65 años

Procedimientos utilizados:

I.  Inclusión y exclusión de sujetos

De todos los pacientes se obtuvo consentimiento informado para la participación del estudio.

II. Recolección de muestras

Las muestras se obtuvieron de los pacientes durante la primeras 48 horas de internación. La gravedad de la enfermedad se evaluó y comparó entre los grupos de estudio usando criterios estándares de la gravedad como el índice de gravedad de la neumonía (PSI), CURB-65, necesidad de hospitalización (UCI vs no UCI), ventilación mecánica y duración total de la hospitalización. El PSI utiliza historial del paciente en cuanto a enfermedades, temperatura, pulso, pH arterial, entre otros, para poder adquirir un valor y de ese observar la morbosidad del paciente. EL CURB-65 se utiliza para adquirir el nivel de gravedad del paciente para entonces decidir el método de tratamiento, antibiótico u hospitalización. Las muestras se adquirieron del tracto respiratorio por medio de una “torunda” para muestra nasofaríngea. Para obtener una población de estudio lo más homogénea posible, no se incluyeron en el estudio sujetos inmunocomprometidos (infectados por VIH y trasplantados). 

           Congelador de infección grave y sepsis donde se almacenan las muestras nasofaríngeas de los pacientes del estudio.

III. Procesamiento de las muestras

Se utilizó la técnica Multiplex- PCR (Film array) para analizar las muestras. Los virus respiratorios que se identificaron fueron: influenza A y B, virus sincitial respiratorio (RSV), metapneumovirus humano (hMPV), virus de la parainfluenza (PIV) tipos 1-4, rinovirus (RV), y coronavirus 229E, OC43 y NL63, adenovirus (ADV), enterovirus (ENV) y bocavirus humano (BOV). En el caso de que la muestra fuese positiva para rinovirus (RV) se realizara la caracterización molecular (secuenciación y análisis filogenético) para identificar especie y genotipo del RV detectado.

Equipo Usado:

http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/tlp/multiplex-pcr-real-time-system.jpg

Protocolo (1):

1) Todos los reactivos para estudiar la muestra ya están en los compartimentos de almacenamiento de reactivos del “film array pouch.” La solución de hidratación se inyecta en la bolsa a través del puerto de entrada azul a la derecha . 300μL de la muestra a estudiar se inyectan en el “film array” a través del puerto de entrada de color rojo. El “film array” luego se inserta en el instrumento y se inicia la carrera. En el caso de este proyecto, me tocó aislar los 300μL de las muestra para luego enviarlos al laboratorio y que allí se llevara a cabo el PCR múltiple.  

                                            Imagen del proceso de aislamiento de la muestra para luego ser enviada al laboratorio. 

2) En primer lugar, la muestra se mueve a la cámara de lisis, donde el “film array" físicamente causa la lisis de las células y los virus a través de un proceso llamado “bead beating.” Bolas pequeñas de cerámica se agitan a alta velocidad para causar la lisis de las células y los virus, liberando los ácidos nucleicos. 

3) Estos ácidos nucleicos son luego unidos a perlas magnéticas, que se mueven desde la cámara de lisis a la cámara de purificación. 

4) Aquí, un lavado con amortiguador elimina cualquier residuo celular y viral restante. El “film array” luego activa un imán fuera del “pouch”, el cual mantiene las perlas magnéticas en su lugar mientras los residuos se eliminan por lavado. 

5) Luego, un amortiguador de elución libera los ácidos nucleicos purificados de las perlas magnéticas. 

6) Las perlas magnéticas están de nuevo magnéticamente aseguradas mientras que los ácidos nucleicos se mueven a la primera etapa de la cámara de PCR. 

7) Un paso de transcripción inversa se realiza para convertir cualquier ARN en ADN. 

8) Esto es seguido por un PCR múltiple de alto orden que utiliza docenas de pares de “primers”. Durante esta primera etapa de PCR, muchas reacciones ocurren simultáneamente. 

9) Los productos de la primera etapa del PCR se diluyen para remover cualquier “primer” de PCR primera etapa restante.

10) Los productos diluidos de la primera etapa de PCR se combinan con un “master mix” y luego son alicuotados a cada celda del “film array.” 

11) Cada celda ya contiene un par de “primers” de PCR de segunda etapa. Los “primers" de la segunda etapa de PCR están diseñados para amplificar secuencias contenidas dentro de los productos de la primera etapa de PCR. Un colorante fluorescente de cadena doble de ADN se utiliza para monitorear cada reacción. Los “primers” de la segunda etapa de PCR son diseñados para detectar un objetivo en especifico. El sistema del “film array” luego procesa la información y se obtiene un positivo o negativo para cada celda. A continuación se puede observar en la imagen un resumen de los explicado anteriormente.

Resultados y discusión breve

Figura 1: Porcentaje de pacientes positivos a algún virus en cada grupo de estudio. En este gráfico se puede observar cómo los grupos de estudio con mayor porcentaje de sujetos positivos a algún virus son los pacientes menor a un año ya que el esquema utilizado es solo de un año (menos amplio) que el esquema en todos los demás grupos de estudio. En otras palabras, el esquema solo abarca 12 meses, mientras que los demás abarcan un mínimo de 4 años.

Figura 2: Número de pacientes positivos a cada virus por grupo de estudio. En este diagrama y tabla se pueden observar todos los virus detectados en el PCR múltiple. Los datos del PCR múltiple, luego de ser obtenidos, se organizaron de manera que se pudiese observar la relación de la presencia de cada virus y las edades de los pacientes. También de acuerdo a los datos, se puede observar cómo el grupo de 5-17 años contiene la menor cantidad de sujetos con algún virus.

Relación con investigaciones previas:

Varias investigaciones previas han concluido que la infección por rinovirus estimula la adhesión de las bacterias tales como S. pneumoniae a las células epiteliales del tracto respiratorio (3). Dado a esto se piensa que el aumento en la adhesión de dicha bacteria puede ser una de las causas por la cual la neumonía se desarrolla luego de la infección por un rinovirus. Por esto es que este proyecto se está llevando a cabo, y así se podría observar la relación entre la infección mixta por rinovirus y bacteria con una peor evolución de la NAC.

Futuro del proyecto:

En el proyecto también tienen varios futuros proyectos en mente como continuación del mismo. Ya que en este proyecto han tratado de mantener la población de estudio lo más homogénea posible, los pacientes inmunocomprometidos no se han incluido en el estudio. Un posible proyecto en un futuro sería de estudiar el rinovirus en la población de pacientes inmunocomprometidos son esos infectados por VIH y/o han recibido un trasplante.

Referencias:

1) Bolivar, Ana M., Rojas, Agustina, y García, Pablo. PCR y PCR múltiple: parámetros críticos y protocolos. 2013. Web.

2) Clínica Universidad de Navarra. Neumonía. España. Web.

3) Ishizuka, Satoshi, et.al. Effects of Rhinovirus Infection on the Adherence of Streptococcus pneumoniae to Cultured Human Airway Epithelial Cells. Japan. 2003. Web.

4) Jain S, Self WH, Wunderink RG, Fakhran S, Balk R, Bramley AM, et al. Community-Acquired Pneumonia Requiring Hospitalization among U.S. Adults. The New England journal of medicine. 2015;373(5):415-27.

5) Makela MJ, Puhakka T, Ruuskanen O, Leinonen M, Saikku P, Kimpimaki M, et al. Viruses and bacteria in the etiology of the common cold. Journal of clinical microbiology. 1998;36(2):539-42.

6) Marcone, Debora N., Guadalupe Carballal, Carmen Ricarte, and Marcela Echevarria. Diagnóstico de virus respiratorios utilizando un sistema automatizado de PCR muúltiples (FilmArray) y su comparacioón con métodos convencionales. Buenos Aires: n.p., 2015. Web. 23 July 2016.

7) Musher DM. Overview of pneumonia. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Goldman's Cecil Medicine. 25th ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2016:chap 97.

8) Pfuntner A, Wier LM, Steiner C. Costs for Hospital Stays in the United States, 2011: Statistical Brief #168. Healthcare Cost and Utilization Project (HCUP) Statistical Briefs. Rockville (MD)2013.

9) Royston L, Tapparel C. Rhinoviruses and Respiratory Enteroviruses: Not as Simple as ABC. Viruses. 2016;8(1).

10) Sánchez, Ignacio, y Álvarez Cecilia. Infecciones respiratorias agudas bajas. 2004. Web.